PH-1621

Terug naar Cursusaanbod 2009

Terug naar Moleculaire biologie 2009

Terug naar Pathologie/Histotechnologie 2009

In situ Hybridisatie

Met in situ hybridisatie (ISH) worden specifieke nucleïnezuurvolgordes in DNA of RNA met behoud van cel- en weefselverband aangetoond. Hiertoe worden gelabelde nucleïnezuur probes in contact gebracht met nucleïnezuur targets in de cellen. Dankzij de visualisering van dit label met gevoelige methoden én de beoordeling met de LM kunnen met ISH relatief gemakkelijk de expressie van genen, en deleties, amplificaties en translocaties van genen en chromosomen binnen een cel worden herkend. ISH heeft een aantal erkende toepassingen binnen de diagnostiek en de research, te weten:

detectie van deleties, amplificaties en translocaties bij de tumordiagnostiek (bv Her2Neu amplificatie, leukemie), pre- en postnatale chromosoomafwijkingen (vruchtwaterpunctie, vlokkentest)

detectie van DNA of RNA virussen (CMV, HPV, EBV, HIV) en van schimmels

detectie van expressie van genen (mRNA) experimenteel onderzoek

In deze cursus worden de theoretische achtergronden van de in situ hybridisatie, en van de bijbehorende moleculaire biologie besproken. Er wordt in de praktijk geoefend in het uitvoeren en beoordelen van een ISH.

Aanvullende cursusinformatie:

Theorie:

Opbouw en structurele organisatie van DNA/RNA; denaturatie, renaturatie

Nucleïnezuurhybridisatie en wasstappen; stringentie; kruishybridisatie

Cel- en weefselbewerking t.b.v. DNA- en RNA in situ hybridisatie (fixatie en inbedding; plakmiddelen; bereikbaarheidsproblemen van targets; verlies aan targets)

Hybridisatiemengsel; samenstelling; eigenschappen; reactieomstandigheden, Tm-berekening

DNA- en RNA-probes; probe-design en probe-bereiding (synthese; opkweek m.b.v. vectoren; PCR)

Labels en labeling (nick translatie; eindlabeling; PCR; 'random primer-extension')

Hybridisatie methoden (oplossing; filters; blotting; in situ; fiber FISH)

Visualisering: fluorescentie (FISH) / chromogeen (CISH), wel/niet radioactief; direct/indirect; affiniteits- en immunolabeling

Kwaliteitscontroles: specificiteit/sensitiviteit; reproduceerbaarheid; artefacten; positieve en negatieve controles

Strategieën en problematiek bij DNA en RNA in situ hybridisatie

Praktijk:

DNA in situ hybridisatie met behulp van een gebiotinyleerde CMV probe. Om inzicht te krijgen in de mogelijkheden en onmogelijkheden van de techniek worden diverse voorbehandelingen op verschillend gefixeerd celmateriaal uitgevoerd

RNA in situ hybridisatie

Gastdocenten:

Dhr. W. Vos (VUMC): EBER RNA ISH

Mw. Drs. A. Mieuweint (VUMC): Chromosoom diagnostiek

Mw. H. Ruijter (NKI): Her2-Neu

Dhr. Dr. H. Baelde (LUMC): probe design

Doelgroep: Laboratoriummedewerkers met een MLO / HLO opleiding werkzaam in de diagnostiek of de research.

Voorkennis: Moleculair biologische achtergronden op het niveau van cursus PH-1530.

Cursusniveau: HBO

Cursusdata: 5, 6, 12 oktober 2009

Lestijden: 09.30-16.00 uur

Omvang: 15 uur theorie, 6 uur practicum

Getuigschrift: bewijs van deelname

Inschrijving: vóór 31 augustus 2009 via het inschrijfformulier

Cursusprijs: € 1.150,- (met vroegboekkorting € 1.095,-)