PH-1633

Terug naar Cursusaanbod 2010

Terug naar Moleculaire biologie 2010

De PCR: theoretische achtergronden en applicaties

Na-inschrijving is mogelijk tot 29 oktober 2010

Deze cursus bespreekt de PCR van 'A' tot 'Z'. Naast alles wat in technische zin met 'design' en de optimalisatie van PCR-bepalingen en bijbehorende achtergronden te maken heeft, komen de kwaliteitscontrole, de analyse van knelpunten en de bedrijfsvoering aan de orde. Accenten worden gelegd op o.a. isolatie van DNA/RNA targets, primer design (tijdens een workshop 'Primer en probe design', speciale primers en primersynthese, reactiemengsel (diverse DNA-polymerasen, hulpstoffen en essentiele componenten). Heel belangrijk is het begrip 'fidelity' van de PCR dat de sleutel vormt voor zowel conventionele als 'Real-Time' applicaties. Ook kwantitatieve methoden (conventioneel, en 'Real-Time') en de analyse van genexpressie met RT-PCR worden besproken. Er is in dit verband uitleg van verwarrende begrippen als 'standaard, controle en referentie'. De post-PCR fase krijgt aandacht met de analyse van amplimeren (fluorescentie, elektroforese, hybridisatie, micro-arrays en sequencen). Bijzondere PCR-technieken ('repeat'-PCR, 'touch down/up', 'time release', multiplex, inhibitie etc.) worden besproken.

Voorafgaande aan gastcolleges over de toepassingen uit verschillende vakgebieden staan kwaliteitscriteria (IQA en EQA) en GLP-procedures voor een PCR laboratorium centraal. Onderwerpen van gastcolleges komen uit de pathologie, (medische/veterinaire) microbiologie, klinische chemie en hematologie, genetica, forensisch onderzoek en agrobotanie.

De cursusprijs van deze cursus is inclusief een workshop 'Primer en probe design (Ph-1638). Deelname is facultatief. Mocht u geen interesse in deze workshop hebben dan brengen wij € 299,- in mindering op de cursusprijs. De workshop 'Primer en probe design' wordt 4 keer per jaar georganiseerd. De workshop die bij deze cursus hoort wordt gehouden op 30 november en 1 december 2009.

Aanvullende cursusinformatie

DNA/RNA targets (herkomst en isolatie); invloed van monster op welslagen van de PCR (remmers en hulpstoffen)

Achtergronden van de PCR o.a. primer design (eisen, varianten, databanken en selectie van primers, Tm en Ta).

Uitvoerige informatie over de workshop 'Primer en probe design' (Ph-1638)

Bestanddelen van reactiemengsel (pH, ionen, hulpstoffen bij speciale applicaties)

Thermostabiele DNA-polymerasen en hun bijzondere toepassingen (o.a. RT-PCR, 'full length' cDNA)

Het begrip 'fidelity' en de manipulatie ervan; wanneer 'proofreading' enzymen nodig?

Conventionele PCR; de PCR cyclus en zijn variabelen, eindpunt van de PCR (semi)kwantitatieve en 'real-time' PCR t.b.v. expressie-bepaling, DNA kwantificatie (bijv. virale targets) en mutatie-onderzoek; het lezen van output parameters bij real time PCR. Overeenkomsten en verschillen tussen Taqman en hybridisatie technologie; gebruik SybrGreen.

Gevoeligheid van de PCR; technieken en knelpunten bij 'singel cell' PCR; kan gevoeligheid te groot zijn?

Identificatie van PCR-producten:

- fluorescerende DNA-kleurstoffen, gelabelde primers en probes ('quenching', 'versterking', 'moleculair beacons')

- smeltcurve analyse

- elektroforese: agarose versus acrylamide; scanners en gevoeligheid; heteroduplex analyse; DGGE; SSCP; BESS-T-scan

- hybridisatietechnieken (Southern blot, dot spot, reverse hybridisatie, LIPA)

- PCR-ELISA en zijn varianten

- PCR als eerste stap bij DNA-chip en micro-array experimenten

Opzet en kwaliteitscontrole van de PCR, strategien

- knelpunt analyse bij fout-positiviteit/negativiteit

- interpretatie van elektroforese-beelden of gelscans al dan niet in combinatie met juiste controles

- speciale problemen bij de opzet van RT-PCR

Kwaliteitscriteria: gevoeligheid, diverse vormen van specificiteit, 'analytical range/sensitivity', 'range finding', efficientie, precisie, fouten-analyse

Valideren en ringonderzoek

Contaminatie-problematiek (bronnen, maatregelen)

Varianten van de PCR

- RT-PCR (RNA-isolatie; cDNA bereiding)

- bereiding PCR-probes (directe- en eindlabeling; 'random priming')

- inverse-; asymmetrische-; 'hot start', 'time-release', 'touch-down', differential display', breukpunt-, inhibitie-, multiplex - methyleringsspecifieke PCR

- 'interrepeat' PCR; PCR-'footprinting'; repeat PCR (o.a. ALU/CA/GATA); AFLP; RAPD; LOH; 'mismatch repair'; microsatelliet instabiliteit

- sequentie analyse m.b.v. PCR-technologie

- expressie van PCR-producten (o.a. PTT); selectie eiwitproducten

- 'site-directed' mutagenese

- SAGE; PCR t.b.v. klonering

Toepassingen van de PCR (gastcolleges):

- klinische genetica; klassiek en via chiptechnologie

- medisch-microbiologische diagnostiek (o.a. bacterietypering, ziekenhuis epidemiologie) m.b.v. 'repeat' PCR

- kwaliteitscriteria en pathogeen- detectie bij sierteeltgewassen

- veterinaire microbiologie

- klinisch-chemische diagnostiek

- kwaliteitscriteria en pathogeen-detectie bij sierteeltgewassen

- veterinaire microbiologie

- klinisch-chemische diagnostiek

- kwaliteitscontrole binnen de virologie (ringonderzoek, validatie, specificiteit, reproduceerbaarheid)

- forensisch onderzoek (dader-onderzoek m.b.v. multiplex PCR; fingerprints).

Gastdocenten: worden nader bekend gemaakt

Doelgroep: HBO- en MBO-ers met enige jaren relevante werkervaring

Voorkennis: Op niveau van 'Basiscursus Moleculaire Biologie' (PH-1630) en 'Introductie tot de Polymerase Chain Reaction' (PH-1631)

Niveau: post-HBO

Aanbevolen studieboek: Principles and Technical Aspects of PCR Amplification by Elizabeth van Pelt-Verkuil, Alex van Belkum, John Hays. Hardcover, ISBN nr. 1402062400, Uitgeverij Springer 2008.

Cursusdata: 19 november, 3 december 2010, 7, 21 januari, 4 en 18 februari 2011

Lestijden: 09.30 - 16.00 uur

Omvang: 42 uur theorie

Zelfstudie: 31,5 uur

Getuigschrift: Bewijs van deelname

Inschrijving: vóór 8 oktober 2010 via het inschrijfformulier

Cursusprijs: € 1.765,- (met vroegboekkorting € 1.680,-)